Главная


https://zaxvatu.net/kino/

Комплементзависимая цитотоксичность. Типирование по HLA-DR

HLA-DR-антигены (англ. HLA-D-relatcd antigens) тесно ассоциированы или идентичны HLA-D-антигенам, они выявлены только у В-лимфоцитов, макрофагов, клеток эндотелия и сперматозоидов. Их определяют модифицированным лимфоцитотоксическим методом с В-лимфоцитами. В-лимфоциты выделяют на найлоновой вате, при помощи метода розеток (ЭБ) или флотации (получаются меченные флюорохромом клетки, двойная флюорохромная метка).

Выделение В-лимфоцитов

Получают лимфоциты по меньшей мере из 10 мл крови и суспендируют в 0,5 мл среды (RPMI +5% сыворотки АВ).

Сепарация В-лимфоцитов на найлоновой вате (так называемый метод «соломки для питья»). Приготовление колонки из найлоновой ваты: пластиковую «соломку для питья» (длиной 19,5 и 0,6 см в диаметре) сваривают по одному концу под углом 45°. В нижнем конце сварного шва прорезают отверстие диаметром 1 мм, через которое будет медленно вытекать суспензия клеток. Колонку заполняют 0,1 г найлоновой ваты на высоту 6 см (1—2 ем от верхнего конца остаются незаполненными), выдерживают 4 дня в дистиллированной воде, затем промывают нагретой до 37°С средой. Наличие воздушных пузырей недопустимо, поскольку они вызывают цитолиз. Подготовленная таким способом колонка пригодна для получения 150х106 клеток. Закупоренные колонки можно длительное время хранить в замороженном состоянии. Найлоновую вату после употребления можно промывать водопроводной водой и использовать повторно (многократно). После промывания подогретой средой колонку инкубируют в горизонтальном положении в течение 30 минут при 37°С. Суспензию лимфоцитов осторожно наносят на верхний конец колонки, наклоненной под углом 45°. В заполненную суспензией колонку вносят еще 0,2 мл среды для предотвращения высыхания. Колонку кладут в горизонтальном положении в термостат (37 °С) на 30 минут, а затем ставят вертикально в сосуд и промывают 5 мл среды, нагретой до 37 °С.

На этом этапе удаляются неадгезировавшие клетки (Т-лимфоциты). Еще раз повторяют промывку 5 мл среды. Адгезировавшие клетки (В-лимфоциты) вымывают средой, охлажденной до 4°С, при равномерном надавливании, повторяют процедуру. Собранные клетки отмывают средой и осаждают центрифугированием в течение 5 минут при 100 g; доводят концентрацию клеток до 3х109 клеток/л.

Контроль выделения В-клеток. В-лимфоциты должны составлять не менее 80% выделенной популяции клеток, для того чтобы можно было проводить титрование по HLA-DR. Позитивный контроль проводят с полиспецифической HLA-DR-антисывороткой, которая вызывает полный лизис В-лимфоцитов и не лизирует Т-лимфоциты. Дополнительный контроль можно проводить маркировкой В-лимфоцитов меченной ФИТЦ антисывороткой против иммуноглобулинов человека.

Модифицированный микротест на лимфоцитотоксичность. Тест проводят в условиях, соответствующих описанным в разделе "Реакция лимфоцитолиза", но время инкубации увеличивают: антисыворотки + В-лимфоциты инкубируют 60 минут, после добавления комплемента инкубацию проводят еще в течение 120 минут при 22°С.

Метод двойной флюоресцентной метки

Выделение лимфоцитов. Лимфоциты из 5 мл гепаринизированной или дефибринированной крови трижды отмывают в растворе Хэнкса, ресуспендируют в 1 мл среды и доводят концентрацию клеток до 5х109 клеток/л.

Мечение В-клеток. К суспензии лимфоцитов (5х106 клеток) добавляют 15 мкл меченной ФИТЦ антисыворотки к иммуноглобулин человека, инкубируют 10 минут при 37°С и трижды отмывают раствором Хэнкса. Ресуспендируют клетки в 0,15 мл среды и устанавливают концентрацию 8х109 клеток/л.

Постановка опыта. Антисыворотку (0,5 мкл) смешивают с 0,5 мкл клеточной суспензии под слоем вазелинового масла и инкубируют 45 минут при 22°С. Добавляют 2 мкл кроличьего комплемента и инкубируют 120 минут при 22°С. Готовят исходный раствор этидий-бромида (10 мг красителя в 50 мл 5% раствора ЭДТА в 0,15 М NaCl). Разводят исходный раствор этидий-бромида 1:230 (растворитель, как для исходного раствора). Для окрашивания к инкубационной смеси добавляют 0,5 мкл разведенного раствора этидий-бромида. Результаты учитывают при помощи инвертированного [микроскопа в люминесцентном свете (фильтр № 12 для Ploeimpak 2 Лейц). В-лимфоциты могут быть идентифицированы по зеленой флюоресценции (так же как и моноциты); у мертвых клеток ядро окрашивается в оранжевый цвет (этидий-бромид). Учитываются только клетки с зеленой флюоресценцией с неокрашенным ядром (живые) и клетки с оранжевым ядром (мертвые клетки, положительная проба).

Сыворотки для HLA-DR

Антисыворотки к HLA-DR получают от иммунизированных доноров. Поскольку они также, как правило, содержат антитела к HLA-A, -В, -С, последние должны быть адсорбированы тромбоцитами, содержащими антигены HLA-A, -В -С, и не содержащими антигенов HLA-DR. Для этого сыворотку смешивают с равным объемом осадка тромбоцитов, инкубируют при 22°С, постоянно помешивая. Тромбоциты удаляют центрифугированием (1000—2000 g). Повторяют адсорбцию со свежей порцией тромбоцитов. Адсорбированные сыворотки не должны реагировать с Т-лимфоцитами. Тромбоциты получают с донорских пунктов. После 25-минутной отмывки 0,14 М NaCl тромбоциты суспендируют в 0,1% азиде натрия и хранят при 4°С до 3 месяцев. Пул тромбоцитов собирают по меньшей мере из 100 лейкоцитарных пленок, что обеспечивает присутствие всех вариантов HLA-A, -В-, -С-антигенов.